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Advance

Bun-Ichi Shimizu

    Department of Biological Resources　Professor
    Course of Life Sciences　Professor
Last Updated :2025/05/24

Researcher Information

Degree

  • Doctor of Agriculture（Kyoto University）
  • Master of Agriculture（Kyoto University）

URL

Research funding number

  • 50324695

J-Global ID

Research Interests

  • Plants/Microbes/Secondary Metabolism/Coumarins/Biosynthesis/   Plants/Pathogenic Fungi/Resistance Reaction/Secondary Metabolism   

Research Areas

  • Life sciences / Bioorganic chemistry

Academic & Professional Experience

  • 2013/04 - Today  Toyo UniversityDepartment of Life SciencesProfessor
  • 2016/04 - 2017/03  Karolinska Institutet, SwedenDepartment of Molecular Biophysics and BiochemistryVisiting Professor
  • 2009/04 - 2013/03  Toyo UniversityDepartment of Life SciencesAssociate Professor
  • 2007/04 - 2009/03  同上 助教
  • 2000/05 - 2007/03  Kyoto UniversityInstitute for Chemical ResearchAssistant Professor
  • 2000  Institute for Chemical Research, KYOTO UNIV. Instructor.

Education

  • 2000/07 - 2000/07  Kyoto University  PhD （Agricultural Science)
  •        - 2000  Kyoto University  農学研究科  博士後期課程修了（応用生命科学）
  •        - 2000  Kyoto University  Graduate School, Division of Agriculture
  •        - 1995  Kyoto University  Faculty of Agriculture  農芸化学科
  •        - 1995  Kyoto University  Faculty of Agriculture

Association Memberships

  • American Chemical Society   日本農芸化学会   日本農薬学会   

Published Papers

Books etc

  • Biochemistry in Plant Metabolism
    SHIMIZU Bun-ichi (ContributorTaxonomy of metabolism in plants)YODOSHA 2019/01
  • Identification of aroma components during processing of the famous oolong tea “Oriental Beauty”
    Ogura M; Kinoshita T; Shimizu B; Shirai F; Tokoro K; Lin ML; Sakata K (Joint workACS Synposium Series 988)American Chemical Society, Washington DC 2008 pp 87-97

Conference Activities & Talks

  • Analysis in terpene contents of leaves of Abies veitchii in different ages.  [Not invited]
    Y. Hoshino; H; Taneda; B. Shimizu
    Symposium on the Chemistry of Terpenes, Essential Oils and Aromatics  2022/11  Oral presentation
  • シラビソ (Abies veitchii) のクチクラアルカンに対する生育環境の影響  [Not invited]
    星野雄; 柏田隼佑; 正木怜也; 種子田春彦; 清水文一
    第 ６ ５ 回 香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会  2021/10  Oral presentation
  • クマリン骨格形成鍵酵素における基質認識に必要な化学因子の探索
    関口 茉樹、清水 文一
    日本農芸化学会 2020年度大会  2020/03
  • 亜高山帯に生息しているシラビソ葉におけるクチクラ成分の分析
    正木 怜也、生方 正章、岩渕 晴男、種子田 春彦、清水 文一
    日本農芸化学会 2020年度大会  2020/03
  • 亜高山帯に生息するシラビソのクチクラ成分の分析とストレスで変化する成分について
    正木 怜也、種子田 春彦、清水 文一
    テルペンおよび精油化学に関する討論会  2019/09
  • 酸化ストレスを受けたシロイヌナズナ葉のオキシリピン類の分析と検出感度の改善  [Not invited]
    西家弘真、清水文一
    香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会  2019/09  Oral presentation
  • Analysis of oxylipins in Arabidopsis leaves subjected to oxidative stress  [Not invited]
    Nishika Hiromasa; Shimizu Bun-ichi
    Annual Meeting of the Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry (JSBBA)  2019/03  Oral presentation
  • Ortho-hydroxylases from Populus trichocarpa have a catalytic activity for caffeoyl CoA.  [Not invited]
    SHIMIZU Bun-ichi
    日本農芸化学会2016年度大会（札幌市）  2016/03  Poster presentation
  • Coumarin degradation metabolism via Melilotic acid by Pseudomonas spp.  [Not invited]
    ○Shun TAMURA; Mami SHIMAZAKI; Masahiro IMAI; Kouki ONODA; Takahiro OKADA; Bun-ichi SHIMIZU
    日本農芸化学会大会（岡山）  2015/03
  • Cloning and functional analysis of genes encoding ortho-hydroxylases involved in scopoletin biosynthesis in Populus trichocarpa.  [Not invited]
    SHIMIZU Bun-ichi○Akari Inaba; Bun-ichi Shimizu
    日本農芸化学会大会（岡山）  2015/03
  • Exploration of substrate recognition mechanism of the ortho-hydroxylases from sweet potato by point mutational analysis  [Not invited]
    Hidetoshi Abe; Sinpei Okawara; Shingo Nagano; Masaharu Mizutani; Bun-ichi Shimizu
    日本農芸化学会大会（岡山）  2015/03
  • Coumarin metabolism by isolated microorganisms from cherry tree.  [Not invited]
    Shun Tamura; Bun-ichi Shimizu
    13th IUPAC International Congress of Pesticide Chemistry@San Franscisco  2014/08
  • サクラ周辺環境より単離された Pseudomonas sp. の クマリンの代謝  [Not invited]
    田村 駿; 島崎真実; 今井政裕; 米山恵介; 岡田貴博; 清水文一
    日本農芸化学会（川崎）  2014/03
  • サツマイモ桂皮酸類オルト位水酸化酵素の基質認識部 位の探索  [Not invited]
    岩田友子; 柴田行範; 槇田雄太; 和田瞭典; 清水文一
    日本農芸化学会（仙台）  2013/03
  • クマリン生合成に関わるソライロアサガオの桂皮酸オ ルト位水酸化酵素遺伝子の機能解析とゲノム配列の解析  [Not invited]
    田辺綾野; 清水文一
    日本農芸化学会（仙台）  2013/03
  • オオマリコケムシの産生するゲル状物質化学構造  [Not invited]
    関根美祈; 清水文一
    日本農芸化学会（仙台）  2013/03
  • サクラ周辺のクマリン分解微生物の単離・同定とクマ リン分解代謝の追跡  [Not invited]
    田村 駿; 須永祐輔; 清水文一
    日本農芸化学会（仙台）  2013/03
  • ソライロアサガオのクマリン生合成に関わるオルト位水酸化酵素遺伝子のクローニングと機能解析  [Not invited]
    田辺 綾野; 清水 文一
    日本農芸化学会（京都）  2012/03
  • 点変異導入によるサツマイモ桂皮酸オルト位水酸化酵素の基質認識アミノ酸残基の探索―C末端領域の検討  [Not invited]
    岩田 友子; 柴田 行範; 清水 文一
    日本農芸化学会（京都）  2012/03
  • ソライロアサガオのクマリン生合成に関わるオルト位水酸化酵素遺伝子のクローニング  [Not invited]
    田辺 綾野; 清水 文一
    日本農芸化学会（京都）  2011/03
  • 新規ブラシノステロイド不活性化経路の解明  [Not invited]
    清水 文一; 水谷 正治; 川邉 綾美; 清水 文一; 嶋田 幸久; 藤岡 昭三; 坂本 知昭
    日本農芸化学会（福岡）  2009/03
  • サツマイモにおけるクマリン化合物生合成  [Not invited]
    松本 征太郎; 水谷 正治; 清水 文一
    日本農芸化学会（福岡）  2009/03
  • 植物由来アシル活性化酵素のケミカルバイオロジ－ (その1) ― アッセイ方法の確立と酵素学的解析 ―  [Not invited]
    内藤 喜之; 斎野 廣道; 水谷 正治; 清水 文一; 平竹 潤
    日本農芸化学会（東京）  2008/03
  • 植物由来アシル活性化酵素のケミカルバイオロジー （その2） ― オーキシン-アミノ酸合成酵素 (GH3) の新たな阻害剤の設計と阻害活性 ―  [Not invited]
    竹内 良徳; 内藤 喜之; 水谷 正治; 清水 文一; 平竹 潤
    日本農芸化学会（福岡）  2008/03
  • クマリン化合物生合成における側鎖異性化およびラクトン化反応  [Not invited]
    清水 文一; 山本 亮太郎; 川村 直裕; 甲斐 光輔; 水谷 正治
    日本農芸化学会（東京）  2008/03
  • サクラの香気成分クマリンの生成に関わるオルト位水酸化酵素およびグルコシダーゼのクローニング  [Not invited]
    山本 亮太郎; 酒井 英里; 甲斐 光輔; 水谷 正治; 清水 文一
    日本農芸化学会（東京）  2008/03
  • サツマイモおよびタバコの桂皮酸類オルト位水酸化酵素遺伝子のクローニング  [Not invited]
    松本 征太郎; 田口 悟朗; 山本 亮太郎; 甲斐 光輔; 水谷 正治; 清水 文一
    日本農芸化学会（東京）  2008/03
  • オーキシン不活性化を制御する化学的ツール―IAA-アミノ酸複合体合成酵素（GH3）阻害剤の in vivo 阻害活性の検討  [Not invited]
    水谷正治; Liz Tai; 平竹潤; 清水文一; 坂田完三
    日本植物生理学会/愛媛大（松山）  2007
  • シロイヌナズナのクマリン生合成に関わる桂皮酸オルト位水酸化酵素の同定  [Not invited]
    甲斐光輔; 清水文一; 水谷正治; 山本亮太郎; 川村直裕; 坂田完三
    日本植物生理学会/愛媛大（松山）  2007
  • 東方美人茶の原料であるウンカ加害チャ葉から単離したシトクロムP450によるモノテルペン水酸化の解析  [Not invited]
    Jeong-Yong Cho; 水谷正治; 木下朋美; 清水文一; 坂田完三
    農芸化学会大会/東京農大（東京）  2007
  • カラスノエンドウ由来 vicianin hydrolase の単糖転移活性  [Not invited]
    戸本浩央; 齊野廣道; 清水文一; 水谷正治; 平竹潤; 坂田完三
    農芸化学会大会/東京農大（東京）  2007
  • オーキシン不活性化を制御する化学的ツール―IAA-アミノ酸複合体合成酵素（GH3）阻害剤の in vivo 阻害活性の検討  [Not invited]
    水谷正治; Liz Tai; 平竹潤; 清水文一; 坂田完三
    農芸化学会大会/東京農大（東京）  2007
  • シロイヌナズナのクマリン生合成に関わる桂皮酸オルト位水酸化酵素の同定  [Not invited]
    甲斐光輔; 清水文一; 水谷正治; 山本亮太郎; 川村直裕; 坂田完三
    農芸化学会大会/東京農大（東京）  2007
  • IAAホメオスタシスの会名を目指した化学的ツールの開発―IAA-amino acid synthetase阻害剤の合成と阻害活性  [Not invited]
    榊優子; 平竹潤; 水谷正治; 清水文一; 坂田完三
    日本植物生理学会/筑波大（つくば）  2006
  • シロイヌナズナのスコポレチン配糖化酵素  [Not invited]
    甲斐光輔; 清水文一; 山口晃; 水谷正治; 坂田完三
    日本植物生理学会/筑波大（つくば）  2006
  • クマリン類縁体生合成に関与するメチル化酵素  [Not invited]
    甲斐光輔; 清水文一; 川村直裕; 山口晃; 水谷正治; 坂田完三
    日本植物生理学会/筑波大（つくば）  2006
  • 茶香気生成誘導因子の探索  [Not invited]
    木下朋美; 吉田克志; 清水文一; 水谷正治; 坂田完三
    農芸化学会大会/京都女子大（京都）  2006
  • シロイヌナズナのスコポレチン配糖化酵素  [Not invited]
    甲斐光輔; 清水文一; 山口晃; 水谷正治; 坂田完三
    農芸化学会大会/京都女子大（京都）  2006
  • シロイヌナズナのクマリン類縁体生合成に関与するメチル化酵素  [Not invited]
    甲斐光輔; 清水文一; 川村直裕; 山口晃; 水谷正治; 坂田完三
    農芸化学会大会/京都女子大（京都）  2006
  • サクラ葉の香気成分coumarin生成に関わるβ-glucosidaseの精製  [Not invited]
    酒井英里; 清水文一; 水谷正治; 坂田完三
    農芸化学会大会/京都女子大（京都）  2006
  • Biosynthetic pathway of coumarins in Arabidopsis thaliana.  [Not invited]
    清水文一; 甲斐光輔; 川村直裕; 山口晃; 渡辺健; 坂田完三
    11th IUPAC International Congress of Pesticide Chemistry, Kobe  2006
  • カラスノエンドウ由来vicianin hydrolase擬似二糖配糖体加水分解活性  [Not invited]
    戸本浩央; 齋野廣道; 清水文一; 水谷正治; 平竹潤; 坂田完三
    日本農芸化学会関西支部大会/京工繊大（京都）  2006
  • 18O2 を用いた植物のクマリン性化合物生合成経路上の酸化反応の分析  [Not invited]
    清水文一; 玉井道子; 甲斐光輔; 坂田完三
    農芸化学会大会/北大（札幌）  2005
  • シロイヌナズナを用いたクマリン類縁体生合成経路の解析  [Not invited]
    甲斐光輔; 清水文一; 水谷正治; 坂田完三
    農芸化学会大会/北大（札幌）  2005
  • 植物および微生物由来の二糖配糖体加水分解酵素における基質認識の比較  [Not invited]
    吉田宏一; 清水文一; 鶴喰寿孝; 森茂治; 高田正保; 水谷正治; 平竹潤; 坂田完三
    農芸化学会大会/北大（札幌）  2005
  • 東方美人茶（台湾烏龍茶）の製造工程において特異的に発現する遺伝子の検索  [Not invited]
    CHO Jeong-Yong; 水谷正治; 木下朋美; 清水文一; 坂田完三
    農芸化学会大会/北大（札幌）  2005
  • オーキシンホメオスタシスの解明を目指した化学的ノックアウト―IAA-アミノ酸複合体 amidohydrolase 阻害剤の合成と阻害活性―  [Not invited]
    久保田恭広; 平竹潤; 水谷正治; 清水文一; 坂田完三
    農芸化学会大会/北大（札幌）  2005
  • オーキシンホメオスタシスの解明を目指した化学的ノックアウト―IAA-amino acid synthetase 阻害剤の合成―  [Not invited]
    榊優子; 平竹潤; 水谷正治; 清水文一; 坂田完三
    農芸化学会大会/北大（札幌）  2005
  • Floral Aroma of Oolomg Tea Are Results of Stress-Responded Reactions in Tea Leaves During The Tea Processing.  [Not invited]
    Sakata K; Mizutani M; Ahn YO; Shimizu B
    International Symposium on Innovation in Tea Science and Sustainable Development in Tea Industry, Hangzhou, China  2005
  • Gene expression profiling during the fermentation process of "Oriental Beauty"  [Not invited]
    Kinoshita T; Cho JY; Mizutani M; Shimizu B; Tsai HT; Chen YL; Lin ML; Sakata K
    International Symposium on Innovation in Tea Science and Sustainable Development in Tea Industry, Hangzhou, China  2005
  • シロイヌナズナにおけるクマリン類縁体の定量  [Not invited]
    甲斐光輔; 清水文一; 坂田完三
    農芸化学会大会/広島大（広島）  2004
  • 植物および微生物由来の二糖配糖体加水分解酵素の基質特異性  [Not invited]
    吉田宏一; 清水文一; Young-Ock Ahn; Seung-Jin Ma; 水谷正治; 坂田完三; 鶴喰寿孝; 森茂治
    農芸化学会大会/広島大（広島）  2004
  • Tracer analysis of the oxidation steps in biosynthesis of coumarins in sweet potato using 18O2  [Not invited]
    Tamai M; Kai K; Shimizu B; Sakata K
    Germany-Japan Seminar on Molecular Regulation of Plant Secondary Metabolism. かずさDNA研（千葉）  2004
  • Chemical profiling in the manufacturing process of "Oriental Beauty".  [Not invited]
    Cho JY; Shimizu B; Kinoshita T; Mizutani M; Chen KR; Chen CL; Sakata K
    International Conference on O-Cha (tea) Culture and Science, Shizuoka  2004

MISC

Research Grants & Projects

  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2021/04 -2025/03 
    Author : 福田 健二; 渡辺 敦史; 寺田 康彦; 清水 文一; 楠本 大; 種子田 春彦; 梅林 利弘
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
    Date (from‐to) : 2020/04 -2023/03 
    Author : 清水 文一
     
    本研究は、植物が生産する抗酸化物質の生理機能の詳細を調べるため、種々の酸化ストレスに暴露された植物体内に生じる生体分子の酸化物を分析した。特に、抗酸化物質としてクマリン化合物の一つであるスコポレチンおよびその配糖体スコポリンに着目した。それらの生合成能を欠損したシロイヌナズナ株（f6'h1株：生合成鍵酵素AtF6'H1遺伝子欠損株）と野生株（WT）を比較することにより、抗酸化活性によって保護される生体成分の特定を目指した。2020年度より申請研究を開始、初年度には１）脂質酸化物の定量法の確立および２）酸化タンパク質の検索、および３）核酸酸化物の定量法の確立を進めた。これらの成果を踏まえ、種々のストレスを与えることによって生じた生体酸化物を定量した。 a）除草剤プリグロックス（有効成分：パラコートとジクワット処理：いずれも光合成系Iに作用し、スーパーオキシドアニオンラジカルを細胞内に発生させる）処理。2万～8万倍希釈物を葉面処理した際生じた脂質酸化物として、9-HODE, 13-HODE, 13-HOTrE, 9-KODE, 13-KODEが、処理後3日後に増加した。この増加量はWTに比べてf6'h1で、より高い蓄積が見られた。この実験で8万倍希釈物処理をした植物体は、処理葉で黄化症状が見られたが、枯死には至らなかった。 b）食塩処理による塩害ストレス（100～300mM）処理。処理後の植物体からDNAを抽出した。この抽出DNAにヌクレアーゼ処理およびホスファターゼ処理をした後、電気化学検出器を用いて8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG）を検出定量した。食塩処理により、葉に色素蓄積症状が見られた。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2011 -2013 
    Author : SHIMIZU Bun-ichi
     
    This study focused on the role of coumarins in plants. Visualization of the key enzyme of coumarin biosynthesis showed spacial detail of its biosynthesis. After infectious stimulation by fungus or elicitors, local induction of coumarin biosynthesis was found around the area of infection. Coumarin degradation in the rhizosphere of Prunus sp. was detected, where coumarin-degrading microbes were isolated. The coumarin degrading microbes were isolated from soil only around Prunus tree. This result indicates the interaction between the plant and the microbe by coumarin. Coumarin degradation pathway by these microbes were determined. The intermediates of degradation showed no activity to other microbes and plants.
  • Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology：Grants-in-Aid for Scientific Research(基盤研究(B))
    Date (from‐to) : 2007 -2009 
    Author : Jun HIRATAKE; 清水 文一; Masaharu MIZUTANI; Bunta WATANABE; Bunichi SHIMIZU
     
    Thisstudy concerns the development and applications of chemical tools that regulate the redox status of cells by designing and synthesizing specific inhibitors of γ-glutamylcysteine synthetase (GCS), therate-determiningenzymeinglutathione synthesis, and γ-glutamyl transpeptidase (GGT), the initial andprimarily important enzyme in the glutathione metabolism.The inhibitors are to serve as chemical probes to investigate the relationships between cell redox potential and various diseases and as leads to agrochemicals and pharmaceuticals, as well as to antiaging cosmetics.
  • Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology：Grants-in-Aid for Scientific Research(基盤研究(B))
    Date (from‐to) : 2006 -2007 
    Author : 坂田 完三; Masaharu MIZUTANI; 水谷 正治; Bun-ichi SHIMIZU; Tomomi KINOSHITA
     
    We made the joint羊esearch contract of two遥ears collaboration with Indian Tea Research Association (TRA) and Tocklai Tea Experimental Station (TIES). Accordingly, we performed the researches as follows:1) Investigation of the manufacturing of Darjeeling tea “Second flash"in India. At the end of May 2006, three researchers from Japan visited TTES at Tocklai, Assam and also Darjeeling in India. We, together with two researchers from TTES, visited several tea gardens in Darjeeling to see the tea manufacturing and the state of the insect擁nfestation. We also collected the tea samples at two gardens. We observed that two kinds of insects, jassid (green leaffly: Empoasca flavescens Fabr.) and thrips (Taeniothrips setiventris Bagnall), are mainly involved in the insect infestation in Darjeeling. In June 2007, Japanese researchers visited TTES. The in様aboratry breeding of the insects was performed at TTES, and the tea leaves artificially infested by the insects were prepared to analyze the effects of the infestation on the characteristic aroma formation of the tea.2) Elucidation of the characteristic aroma formation of Darjeeling tea “Second flash"produced with the insect擁nfested leaves. The samples collected at the Darjeeling tea gardens in 2006 were analyzed by GC-MS, and it was suggested that insect infestation is involved in the aroma formation such as monoterpene alcohols and hotrienol. It was also evident from the experiments in 2007that insect infestation is mainly concerned with the characteristic aroma formation. The other experiments conducted at a Japanese tea garden demonstrated that the infestation by tea green様eafhopper (a very similar insect to jassid) is involved in the formation of 2,6-dimethylocta-3,7-diene-2,6-diol.3) Attempts to develop a new manufacturing process of CTC black tea. We suggested to the TTES researchers that they should apply the concept in manufacturing Taiwan oolong tea to Indian black tea manufacturing to improve the quality of the flavor of CTC black tea. According to our suggestion, they tried the tea manufacturing with a pilot plant at TTES, and found that the additional processes of some mechanical damages on tea leaves during the withering may improve the quality of the tea flavor.
  • Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology：Grants-in-Aid for Scientific Research(基盤研究(B))
    Date (from‐to) : 2004 -2006 
    Author : Jun HIRATAKE; Masaharu MIZUTANI; Bun'ichi SHIMIZU
     
    The function and the physiological roles of plant β-glycosidases have been studied by using p-glycosylamidines as molecular probes. p-Glycosylamidines, newly developed p-glycosidase inhibitors that selectively inhibitβ-glycosidases according to their glycon substrate specificities, have been successfully used as ligand for affinity chromatography of glycosidases. High fidelities of β-glycosylamidines as specific binders toward theβ-glycosidases with the corresponding glycon substrate specificities enabled one-step affinity purification of specific β-glycosidases from natural samples according to their glycon substrate specificities as a sole marker. This method has been successfully used for the isolation of diglycoside-specific p-glycosidases from microbes and a p-N-acetylhexosaminidase from insect cells. The latter glycosidase is a key biosynthetic enzyme in processing insect-cell-specific N-glycans. With this research tool in hands, we have purified and characterized diglycoside-specific β-glycosidases (diglycosidases) from plants. The diglycosidases are thought to play a key role in self-defense system in plants by emitting defense chemicals such as linalool, 2-phenylethanol and mandelonitrile by cleaving their precursor diglycosides. β-Primeverosidase (PD), a typical diglycosidase found in tea leaves, has been purified to homogeneity by a newly developed pH-controlled affinity chromatography with p-primeverosylamidline as an affinity ligand. The enzymatic properties of PD and the binding mechanism of the β-primeverosylamidine inhibitor have been studied extensively. Furthermore, a gene encoding PD was cloned from tea leaves and was analyzed to find that the diglycosidases were a member of family 1 glycoside hydrolase with significant sequence similarities to the β-glucosidases in this family. This result suggests that plant diglycosidases have been evolved from family 1 β-glucosidases for cleavage of specific diglycosides and serve as a key enzyme in plant self-defense system. The recombinant PD was expressed and highly purified by the affinity chromatography for X-ray structural analysis. The high resolution X-ray crystal structure (1.8 Å) of PD in complex with the β-primeverosylamidine inhibitor revealed the amino acid residues recognizing the β-xylosyl moiety of β-primeveroside and the unique binding mode of β-primeverosylamidine ligand in the active site. These results cogently suggested the structural basis for their unique substrate specificities and the evolutional link between plant diglycosidases and family 1 p-glucosidases.
  • Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology：Grants-in-Aid for Scientific Research(基盤研究(B))
    Date (from‐to) : 2004 -2006 
    Author : Kanzo SAKATA; Jun HIRATAKE; Masaharu MIZUTANI; Bunichi SHIMIZU; Hiroaki KATO
     
    1) Clarification of substrate specificities and catalytic mechanisms of diglycosidases1-a) X-Ray crystallographic analysis of β-primeverosidase from a tea plantWe have succeeded in synteshis of a potent glycosidase inhibitor, β-primeverosyl amidine, for a representative diglycosidase, β-primeverosidase. Single crystalls of β-primeverosidase binding the inhibitor was obtained and subjected to X-ray crystallographic analysis to obtain the structure of the protein with resolution of 1.8 A based on the structure of a family 1 β-glucosidase from maize. The structure allowed us to identify the amino acid residures that interact with disaccharide moiety of the substrates and to show the detailed structure of the opening part of catalytic site. Based on these observations and the substrate specificities of the enzyme we could have understood the substrate recognition mechanism of the enzyme in detail.1-b) Clarification of the substrate recognition mechanism of a diglycosidase by the use of 6'-substituted β-D-glucopyranosidesPseudo-disaccharide glycosides with various kinds of S-substituents (alcohols of C_<2_4> and D-xylopyranosyl) at C-6'of p-nitrophenyl (pNP) β-D-glucopyranosides were synthesized and subjected to hydrolysis by a diglycosidase, vicianin hydrolase. This diglycosidase shows high reactivity against pNP β-primeveroside, but little activity against 6'-S-substituted pNP β-primeveroside as well as pNPβ-D-glucopyranoside. This enzyme shows high activity against pseudo-diglycosides with a straight chain C3-alcohol substituent at C-6'. These observations suggest that the hydroxy group of the C_3-alcohol substituent interacts with the amino acid residues concerned with the recognition of the disaccharide moeiety of natural substrates.2) Distribution of diglycosidases in plant kingdom and analysis of molecular evolution of diglycosidasesBy the use of pNP P-primeveroside as a substrate diglycosidases were screened among plant crude enzymes randomly selected. Out of 18 kinds of plant species β-primeverosidase-like activity was found in the crude enzyme of 7 kinds of plants, indicating considerably wide distribution of diglycosidases among plant kingdom.Phylogenetic tree analysis of diglycosidases, β-primeverosidase, furcatin hydrolase and vicianin hydrolase in family 1 of glycosyl hydrolases were carried out based on their full amino acid sequences, indicating that these diglycosidases cluster with each other.
  • 文部科学省：科学研究費補助金(萌芽研究)
    Date (from‐to) : 2004 -2005 
    Author : 坂田 完三; 平竹 潤; 清水 文一
     
    申請者らは微生物由来ジグリコシダーゼと植物由来ジグリコシダーゼの基質認識の違いを明らかにするため,6-位に種々の修飾基を導入したp-ニトロフェニルグルコシド(6-modified pNPGlc)を合成し,これらに対する活性をそれぞれの酵素に対して測定した.申請二年目において,6-modified pNPGlcの植物由来ジグリコシダーゼに対する結合実験を行った.その結果,用いた3つの植物由来ジグリコシダーゼのうちプリメベロシダーゼおよびフルカチンハイドロラーゼは,6-modified pNPGlcに対して結合能を全く示さなかったのに対して,ビシアニンハイドロラーゼは炭素鎖長が3および4の6-modified pNPGlcに対して結合活性を示した.進行した反応は,活性は低いながらも,与えた基質の水酸基に対する糖転移反応であった.この転移反応系にグルコースを糖受容体として混在させても,転移反応はグルコースに対して進行せず,与えた基質の水酸基に対してのみ生じた.植物由来の3つのジグリコシダーゼのアミノ酸配列を立体構造を考慮して比較すると,活性ポケット入り口に位置するTrpが6-modified pNPGlcに対して結合・糖転移能を示したビシアニンハイドロラーゼのみに存在することが分かった.その他2つのこの位置はAlaであった.このことからこのTrpが芳香環π-π相互作用により基質認識,とくにアグリコンの芳香環認識だけでなく,糖転移反応における糖受容体の認識に関わっていることが示唆された.さらに用いた基質の水中での立体構造を1D-1H,2D-NMR,およびNOE, NOESYを用いて解析を行っている.
  • 植物二次代謝産物クマリン化合物の生合成経路および機能解明
    Date (from‐to) : 2005
  • Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology：Grants-in-Aid for Scientific Research(基盤研究(B))
    Date (from‐to) : 2003 -2004 
    Author : Kanzo SAKATA; Bun-ichi SHIMIZU; Masaharu MIZUTANI
     
    Oriental Beauty is a flavor-rich oolong tea produced from tea leaves infested by the tea green leafhopper (Jacobiasca formosana) in Taiwan. We have studied to clarify the molecular basis of the characteristic aroma formation of the tea by various approaches such as natural product chemistry, biochemistry, and molecular biology. Oolong tea samples were prepared from tea leaves infeted/noninfested by the insects. Samples were obtained at each step of the manufacturing process and subjected to evaluation tests by professional tea tasters and to GC-MS analysis. The tea produced from tea leaves infested by the insects was found to be superior in the quality and quantity of aroma to that from tea leaves without or with much less the insect attack. Hotrienol and its related compound, 2,6-dimethyl-3.7-octadiene-2,6-diol, were confirmed to be responsible for the insect attack. Genes induced in response to the insect attack and the tea manufacturing processes were identified by the differential screening based on the Megasort analysis. Among them our interests were focused into the genes encoding the stress-responded ones and the amounts of the stress-responded compounds such as raffinose and abscisic acid in tea samples obtained at each step of the tea processing were quantitatively analyzed by HPLC. Both compounds were found to increase dramatically at the solar withering step in good correlation with the expression of the genes responsible for their biosynthesis at the step. These results have revealed that the tea leaves of Oriental Beauty are greatly affected by the stresses of the insect attack and the tea manufacturing processes such as solar withering and turning-over, and these stresses are important factors to increase the production of the aroma compounds characteristic to this characteristic oolong tea.
  • 文部科学省：科学研究費補助金(萌芽研究)
    Date (from‐to) : 2003 -2003 
    Author : 平竹 潤; 清水 文一; 水谷 正治
     
    本研究は、グルコース、ガラクトースおよびキシロースから合成した一連のβ-グリコシルアミジン誘導体を、直接、植物(シロイヌナズナ)に与え、その結果観察される、植物の生育および形態上の変化を手がかりに、植物の生理現象にどのような種類のグリコシダーゼが関与しているか、その手がかりを得ることを目的としたものである。そこで、ベンジル基を共通のアグリコン部とし、グルコース、ガラクトースおよびキシロースをグリコン部とする3種類のβ-グリコシルアミジン誘導体(Glc-amidine,Gal-amidineおよびXyl-amidine)を合成し、それぞれの化合物を固形寒天培地(GM培地)に適量加えて、シロイヌナズナ(野生株)を播種あるいは幼植物体を培養し、植物の生育状況と形態を経時的に観察した。その結果、Xyl-amidineを加えた場合のみ、葉の色が黄色くなり、葉の厚みが薄くて垂れ下がった異常な形態を示すことが観察された。また、これらの変化には濃度依存性が見られ、アッセイに用いた最小濃度である0.1μMのXyl-amidine存在下でも、顕著な変化が見られた。一方、グリコン部の構造の異なるGlc-およびGal-amidineでは、このような異常な形態は観察されず、また、構造的に類似したβ-キシロシルアミド(Xyl-amide)でも、この変化は見られなかった。Xyl-amideにはβ-キシロシダーゼ阻害活性がほとんどないことから、シロイヌナズナに見られた形態上の変化はXyl-amidineに特徴的なもので、これら形態上の変化には、何らかの形でβ-キシロシダーゼの阻害が関与していることが示唆された。一方、植物から抽出した粗酵素液には、高いβ-グルコシダーゼ活性およびβ-ガラクトシダーゼ活性とともに、低いレベルではあるがβ-キシロシダーゼ活性が観測された。In vitroでの阻害実験により、それぞれの酵素活性は、対応するアミジン誘導体によって強く阻害され、特に、粗抽出液中のβ-キシロシダーゼ活性は、Xyl-amidineによって完全に阻害されることが判明した。この結果は、植物の形態異常を引き起こす原因が、β-キシロシダーゼの阻害にあるというin vivoでの結果を裏付けるものである。
  • Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology：Grants-in-Aid for Scientific Research(基盤研究(B))
    Date (from‐to) : 2001 -2003 
    Author : Kanzo SAKATA; Bunichi SHIMIZU; Masaharu MIZUTANI; Jun HIRATAKE; Hiroaki KATO; Kanzo SAKATA
     
    The following research results have been obtained by this research project.(A)Clarification of catalytic mechanisms of the diglycosidases and their stereostructures1)Substrate specificities of diglycosidases such as tea leaf β-primeverosidase (PRD), furcatin hydrolase (FH) in Viburnum furcatum, Vicianin hydrolase (VH) in Vicia angustifolia var. segetalis have been studied with various kinds of synthetic and natural substrates to show that these diglycosdiases are very specific to disaccharide glycosides with β-1,6 linkage.2)The full-length cDNA of PRD and VH were overexpressed in insect cells and that of. FH in E.coli. The recombinant PRD was obtained at ca. 30 mg/liter of the medium. This allowed us to try crystallization of the protein for X-ray crystallographic analysis.3)We have developed a new type of glycosidase inhibitors, glycosylamidines, with potent and selective activities. An affinity adsorbent with a ligand of β-primeverosyl has been prepared and was found to be quite effective for purification of PRD as well as the other diglycosidases.(B)Establishment of a new family of diglycosidases in plant kingdom and clarification of their physiological rolesThe anti-PRD antibody prepared with the recombinant PRD was found to be highly selective and sensitive. Application of this- antibody allowed us to know the expression of the PRD gene at higher level in the younger tea leaves and the localization of the PRD in cell membrane or intercellular space.Distribution of diglycosidases was surveyed by using. β-primeverosidase activity, detection of disaccharide formation with TLC and immunoblotting analysis with the anti-PRD antibody among several kinds of plants most of which are known to contain some disaccharide glycosides. The results strongly suggest wide range of distribution of diglycosidases in plant kingdom.
  • 植物二次代謝産物生合成酵素の探索
    Date (from‐to) : 2003
  • Cloning of Enzymes Related to Plant Seconary Metabolisms
    Date (from‐to) : 2003
  • 文部科学省：科学研究費補助金(萌芽的研究, 萌芽研究)
    Date (from‐to) : 2001 -2002 
    Author : 坂田 完三; 清水 文一; 平竹 潤
     
    前年度の予備的成果をもとに、種々のアグリコンを有する配糖体からなる基質ライブラリーを混合物のまま各種グリコシダーゼに作用させ、遊離するアグリコンをGC-MS等で経時的に追跡・定量することにより、グリコシダーゼのアグリコン特異性を迅速かつ簡便に評価し、それをパターンとして特徴付けることができる画期的な新手法の開発に成功した。グリコシダーゼの基質特異性は速度論的パラメーターであるk_/K_m値によつて評価されるが、これを求めるのは大変手間がかかる。重要なのはk_/K_m値の比であることに注目し、ミカエリス-メンテンの仮定をもとに、2つの基質AとBが競合する時、v_A/v_B={(k_/K_m)_A/(k_/K_m)_B}([A]/[B])…(1)となることから、複数の基質を混合して酵素反応を行い、その反応初速度からk_/K_m値の比を迅速に決定できる可能性があることを見出し、β-グルコシダーゼをモデルにして、以下のように研究を行った。基質となるβ-グルコシドとして、C_<5〜8>の種々のアルコールをアグリコンとする6種のモデル化合物(1a-f)を合成した。まず、混合基質を用いた酵素反応により生成したアルコールの混合物を抽出し、GC-MSで一度に分離、定量する一連の方法を確立し、ここに提案した方法で真の基質特異性が評価が可能か検証した。アーモンド由来のβ-グルコシダーゼに対して、1a-fの基質それぞれを単独で反応させて速度論的パラメーターV'_/K_mを得た。次に、6種類の基質1a-fを混合して反応させ、それぞれの基質に対する初速度v'を求めた(V'_およびv'は、見かけのV_およびvを、用いた酵素単位(U)で割った値)。その結果、混合基質を用いて酵素反応を行った場合の、各基質のv'の相対値は、個々の基質を用いて測定したV'_/K_mの相対値によく一致し、この方法により酵素の相対的な基質特異性を簡便に求められることが確かめられた。反対に、1a-fの基質それぞれを単独で用いて酵素反応を行った場合、それぞれの基質の反応初速度v'の相対値はV'_/K_mの相対値と一致しなかった。これは、式(1)が示す通り、一定濃度の基質を単独で用いた場合、その反応初速度を比較しても真の基質特異性は評価できず、基質を混合して反応させた場合には、反応初速度から真の基質特異性が評価できることを示している。次に、Aspergillus niger由来のβ-グルコシダーゼに対して同様に調べた結果、v'の相対値はアーモンド由来のβ-グルコシダーゼとは異なるパターンを示し、この酵素固有のアグリコン特異性を示したことから、この方法で各β-グルコシダーゼのアグリコン特異性の特徴が表せることが明らかとなった。
  • 植物病原菌の病原性決定因子の解明
    Date (from‐to) : 1996
  • study on mechenism of pathogevests in plants.

Committee Membership

  • 2022/10 - Today   NioiN Society for Natural Aroma   committee member

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